在生物技術(shù)和制藥領(lǐng)域，細胞和生物制品的支原體污染是一個需要高度關(guān)注的問題。支原體是一類微小的原核生物，其污染可能導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量下降，甚至引發(fā)嚴(yán)重的安全問題。因此，歐洲藥典（EP）和日本藥典（JP）都對細胞和生物制品的支原體檢測做出了詳細的規(guī)定，并強調(diào)了方法學(xué)驗證的重要性。

支原體檢測的描述

歐洲藥典和日本藥典均指出，無論是生物源性原材料、采用細胞培養(yǎng)技術(shù)制備的疫苗、抗體，還是細胞或基因治療產(chǎn)品，在其生產(chǎn)過程的各個階段都必須進行支原體污染的檢測。支原體檢測的方法主要是基于核酸擴增技術(shù)（NAT），如PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）和qPCR（熒光定量PCR）等。這些技術(shù)通過檢測支原體的特異核酸序列，以確定細胞上清或生物制品中是否存在支原體污染。

方法學(xué)驗證的規(guī)定

1. 靈敏度（檢測限）驗證

歐洲藥典和日本藥典都要求NAT法的靈敏度必須達到一定的標(biāo)準(zhǔn)。具體而言，如果NAT法用于替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，其檢測限需達到10CFU/ml（菌落形成單位/毫升）。這意味著，NAT法能夠檢測到每毫升樣品中至少10個支原體菌落。如果NAT法用于替代DNA染色法，其檢測限則需達到更高的100CFU/ml。

為了確保NAT法的靈敏度達到這一標(biāo)準(zhǔn)，需要使用支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品進行驗證。這些標(biāo)準(zhǔn)品通常是凍干粉型的滅活支原體，涵蓋了藥典規(guī)定的所有支原體物種。通過將這些標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品一起進行檢測，可以驗證NAT法的檢測限。

2. 特異性驗證

特異性是指NAT法能夠準(zhǔn)確識別并檢測的支原體物種，而不與其他細菌或哺乳動物DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。歐洲藥典和日本藥典都規(guī)定了NAT法應(yīng)能檢測的常見支原體物種，如萊氏無膽甾原體、發(fā)酵支原體、豬鼻支原體等。同時，藥典還要求NAT法應(yīng)檢查與細菌、哺乳動物DNA是否有交叉反應(yīng)。

為了驗證NAT法的特異性，可以使用支原體基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品進行試驗。這些標(biāo)準(zhǔn)品包含了特定支原體物種的基因組DNA，通過PCR或qPCR檢測可以驗證NAT法對這些支原體物種的識別能力。

3. 耐用性驗證

耐用性是指NAT法在檢測過程中不受方法參數(shù)的小的偏差的影響，如濃度的變化（MgCl2、引物、dNTP）、提取步驟的細微差別等。這要求NAT法的檢測結(jié)果具有穩(wěn)定性和可靠性，不受人為操作誤差的影響。

耐用性驗證通常通過多輪不同時間段內(nèi)的檢測來實現(xiàn)，每輪進行多次重復(fù)檢測，最后觀察結(jié)果的變化。這樣可以確保NAT法在不同的實驗條件下都能得到穩(wěn)定可靠的結(jié)果。

歐洲藥典和日本藥典對細胞和生物制品的支原體檢測做出了詳細的規(guī)定，并強調(diào)了方法學(xué)驗證的重要性。通過靈敏度、特異性和耐用性三個方面的驗證，可以確保NAT法在支原體檢測中的準(zhǔn)確性和可靠性。這對于保障生物制品的質(zhì)量和安全性具有重要意義。

在實際操作中，生物制品和細胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)企業(yè)需要按照藥典的要求選擇合適的支原體檢測方法和試劑盒，并進行方法學(xué)驗證。同時，他們還需要注意樣本的采集、處理和儲存等環(huán)節(jié)，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。只有這樣，才能為消費者提供安全、有效的生物制品和細胞治療產(chǎn)品。