支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，較為常見又十分棘手的問題。日常實(shí)驗(yàn)中，需要對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境定期清潔；對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液、培養(yǎng)基和生物制藥生產(chǎn)環(huán)節(jié)進(jìn)行的支原體污染監(jiān)測。尋找一種快速、可靠和節(jié)省時(shí)間的常規(guī)監(jiān)測手段對(duì)于提高實(shí)驗(yàn)效率、維持實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定十分重要。

德國Minerva Biolabs公司生產(chǎn)的Venor®GeM經(jīng)典試劑盒，為檢測細(xì)胞培養(yǎng)物和其他生物基質(zhì)中支原體而設(shè)計(jì)?；趥鹘y(tǒng)PCR方法，可實(shí)現(xiàn)快速、穩(wěn)健、高靈敏度的支原體污染檢測。

產(chǎn)品名稱：支原體常規(guī)PCR檢測試劑盒

英文：Venor® Gem Classic    

品牌：Minerva-Biolabs®    

貨號(hào)：11-1025

規(guī)格：25次/盒  

產(chǎn)品特點(diǎn)及原理

該試劑盒針對(duì)支原體基因組中的一個(gè)高度保守區(qū)域：16s rRNA編碼區(qū)，以檢測歐洲藥典第2.6.7章(EP 2.6.7)、日本藥典第G3章(JP G3)和更多物種中包含的所有物種，根據(jù)支原體種類的不同，擴(kuò)增子的大小在265-278 bp之間。

試劑盒設(shè)計(jì)滿足EP 2.6.7和JP G3不同樣品材料(如細(xì)胞培養(yǎng)上清、細(xì)胞培養(yǎng)基、Tris緩沖液)的檢測標(biāo)準(zhǔn)。該檢測方法適用于通常用于研究的細(xì)胞培養(yǎng)上清、“細(xì)胞培養(yǎng)富集"方法或DNA提取后的支原體直接檢測。該試劑盒符合EP 2.6.7和JP G3的要求。

整個(gè)測試僅需要3小時(shí)左右的時(shí)間，并且與基于發(fā)光的酶測定、熒光染色或培養(yǎng)方法相比，不需要活的支原體細(xì)胞。

使用方法詳解

一、普通細(xì)胞培養(yǎng)物的預(yù)處理

當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到80% - 90%的融合度時(shí)，收集樣品。細(xì)胞培養(yǎng)上清液非常適合支原體試驗(yàn)，不需要額外的樣品制備。

細(xì)胞培養(yǎng)中支原體的平均滴度為10^6-10^8顆粒/ ml。在此范圍內(nèi)，上清液中存在足夠數(shù)量的支原體DNA，可以成功應(yīng)用PCR檢測。

1. 從細(xì)胞培養(yǎng)液中取100µl上清至1.5 ml反應(yīng)管中。把蓋子蓋緊。

2. 將樣品上清液在95℃下孵育10分鐘(至少5分鐘)。

3.以最大轉(zhuǎn)速離心樣品。15秒的速度使細(xì)胞碎片成顆粒。

4. 直接使用2µl進(jìn)行PCR，或在+2至+8°C或≤- 18°C下長期保存樣品6天。

二、.生物藥或需遵循藥典的預(yù)處理

1、樣品富集

（可根據(jù)實(shí)際情況選做）

對(duì)于樣品體積> 200µl，建議采用樣品富集的方法以獲得最佳靈敏度。請(qǐng)注意，樣品濃度方案只適用于完整的支原體細(xì)胞。

因此，在樣品濃縮之前，必須避免任何破壞細(xì)胞的程序(例如通過熱失活)。可直接處理200µl體積的樣品，無需樣品

濃度的一步。

① 將最多1ml樣品上清液轉(zhuǎn)移到1.5 ml反應(yīng)管中。

② ≥10,000 x g離心15分鐘(或≥13,000 x g離心6分鐘)，使支原體顆粒成球。

③丟棄上清，用200µl Tris緩沖液(10 mM Tris- hcl, pH 8.4)重懸小球。

④使樣品短暫旋轉(zhuǎn)，然后立即進(jìn)行樣品穩(wěn)定或DNA提取。

2、樣品預(yù)穩(wěn)定

（可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選做）

細(xì)胞培養(yǎng)樣品可能含有高濃度的DNA酶，即使在低溫下也會(huì)降解支原體DNA。因此，我們建議采取以下步驟來穩(wěn)定樣品。如果在樣品采集后立即進(jìn)行DNA提取，則可以省略此步驟。

①從細(xì)胞培養(yǎng)液中取500µl上清轉(zhuǎn)移到1.5 ml反應(yīng)管中。把蓋子蓋緊。

②樣品在95°C下孵育10分鐘。

③以最大轉(zhuǎn)速離心樣品。速度短暫(15秒)，以顆粒細(xì)胞碎片。

④用樣本提取DNA。在+2至+8°C或≤- 18°C的條件下長期保存樣品，最長可保存6天。

3.DNA提取

大量證據(jù)表明，需要提取DNA才能達(dá)到比較高的靈敏度。許多DNA提取方法建立了各種各樣的樣品材料。然而，DNA提取方法必須與支原體和樣品特異性相適應(yīng)。對(duì)于EP和jp兼容的測試，DNA提取方法必須與PCR試劑盒結(jié)合進(jìn)行測試。我們推薦Venor®GeM樣品制備試劑盒(Cat：56 - 1010 / -1050/-1200)。該DNA提取試劑盒為此目的進(jìn)行了廣泛的測試。

一、準(zhǔn)備PCR試劑

二、配制反應(yīng)體系

普通細(xì)胞培養(yǎng)物

14.5 µl 水

2.5 µl 10×緩沖液

2.5 µl 引物/dNTP溶液

2.5 µl 內(nèi)控

1.0 µl Taq酶 (1 unit)

每個(gè)PCR管移液23µl，丟棄剩余材料，使反應(yīng)混合物渦旋5秒。

生物藥或需遵循藥典的樣本

體系包含：

6.5 µl 水

2.5 µl 10×緩沖液

2.5 µl 引物/dNTP溶液

2.5 µl 內(nèi)控 

1.0 µl Taq酶 (1 unit)

每個(gè)PCR管移液23µl，丟棄剩余材料，使反應(yīng)混合物渦旋5秒。

三、加樣

在配制好的反應(yīng)體系中，分別加入陰性(無模板對(duì)照，NTC)對(duì)照、陽性對(duì)照、樣品.

普通細(xì)胞培養(yǎng)物

• 陰性對(duì)照:加入2µl PCR級(jí)水(白色帽)。

• 樣品:加入細(xì)胞培養(yǎng)上清或DNA提取液2µl。

• 陽性對(duì)照:加入2µl陽性對(duì)照DNA(綠色帽)。

• 關(guān)閉并渦旋所有PCR管，加載PCR儀并啟動(dòng)程序。

  
  

生物藥或需遵循藥典的樣本

• 陰性對(duì)照:加入10µl PCR級(jí)水(白色帽)。

• 樣品:加入DNA提取液10µl。

• 陽性對(duì)照:加入2µl陽性對(duì)照DNA(綠色帽)。

• 關(guān)閉并渦旋所有PCR管，加載PCR儀并啟動(dòng)程序。

四、開始擴(kuò)增

將PCR管放入PCR儀并蓋緊蓋子，按照下圖中的程序設(shè)置PCR儀，并開始程序。

五、瓊脂糖凝膠電泳與結(jié)果分析

注意事項(xiàng)

?由于細(xì)胞碎片對(duì)PCR反應(yīng)的負(fù)面影響，不能直接使用細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行檢測。細(xì)胞顆粒、胎牛血清(FCS> 5%)、疫苗、冷凍儲(chǔ)存和石蠟包埋樣品，在PCR前需要提取DNA。Venor®GeM經(jīng)典試劑盒使用Venor®GeM樣品制備試劑盒(Cat.56-1010/-1050/-1200)進(jìn)行DNA提取。提取的DNA可在+2至+8°C下保存6天。長期儲(chǔ)存必須在≤- 18°C。

?培養(yǎng)基中的青霉素或鏈霉素不抑制支原體，也不影響試驗(yàn)的敏感性。

?不建議將不同批號(hào)的試劑混合使用。試劑盒中的試劑如果超過保質(zhì)期，也不建議使用。

?嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范。任何偏差都可能影響測試方法和結(jié)果。

?如果提取DNA，使用新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基或洗脫緩沖液作為陰性對(duì)照。

?在陰性對(duì)照和測試反應(yīng)后準(zhǔn)備陽性對(duì)照，避免交叉污染。PCR抑制可能是由樣品基質(zhì)引起的，或者在提取DNA的情況下，由洗脫緩沖液引起的。因此，我們推薦Venor®GeM樣品制備試劑盒。任何其他DNA提取試劑盒都需要驗(yàn)證。